PEDを用いたトマトの変異検出

Ubuntuのインストール

• Ubuntu Desktop 日本語 Remixより日本語版のISOイメージのファイルをダウンロードします。
• Ubuntu 20.04 LTSインストールガイド【スクリーンショットつき解説】が詳しいので参考にしてインストールしてください。
  PEDは解析時間をできるだけ短くするため、CPUの限界近くまで負荷がかかりますのでほかのOSとの共存は避けた方がいいです。
  使わなくなった古いコンピュータなどにインストールして専用にするのがお勧めです。
  マルチスレッドで動作しますので、4あるいは8コアのCPUを用いると早く処理できます。
  VirtualBoxを用いてWindowsマシンで解析する方法や、クラウドで実行する方法もあります。

PEDのセットアップと解析例

• 必要なソフトをダウンロードとインストールを行います。

  $ sudo apt update
  $ sudo apt upgrade
  $ sudo apt install curl
  $ sudo apt install git
  $ git clone https://github.com/akiomiyao/ped.git

• NCBIのアーカイブのダウンロードにはsratoolkitに含まれるfastq-dumpが必要です。
  最近のバージョンのfastq-dumpは使用前にvdb-configコマンドで実行環境を設定する必要があります。
  設定方法は、[fastq-dumpの設定]のページに記載しました。
• NCBI sequence read archive (SRA)からトマトの配列をダウンロードします。
  $ cd ped
  $ perl download.pl accession=ERR5348981
  $ perl download.pl accession=ERR5348982
  
• ped.plで多型検出を行います。
  $ perl ped.pl target=ERR5348981,ref=SL3
  $ perl ped.pl target=ERR5348982,ref=SL3
  解析結果は、targetディレクトリの中に出力されます。
• Dockerを用いる場合は、以下のようにします。ped.plを直接実行する場合は不要です。
  $ sudo apt install docker
  $ sudo apt install docker.io
  で、docker関連のプログラムがインストールできます。
  実行例
  $ sudo docker pull akiomiyao/ped
  $ sudo docker run -w /ped -v `pwd`:/work akiomiyao/ped perl download.pl accession=ERR5348981,wd=/work
  $ sudo docker run -w /ped -v `pwd`:/work akiomiyao/ped perl ped.pl target=ERR5348981,ref=SL3,wd=/work
  上記コマンドをコピー・ペーストしてアクセッション名等の値を修正して実行するのが楽です。
  Googleのクラウドやアマゾンウェブサービス(AWS)でも実行可能です。
• プライベートなデータの解析
  お持ちのプライベートなfastqファイルを解析する場合は、download.plを実行した時にできるディレクトリ構造と同じディレクトリ構造でリードデータを配置します。
  例
  $ cd ped
  $ mkdir momotarou
  $ mkdir momotarou/read
  $ cp read_data_dir/foo.fastq momotarou/read
  $ perl ped.pl target=momotarou,ref=SL3
  ped.plのターゲット名は、作ったディレクトリ名を指定します。
  fastqファイルは、.gz、.bzip2、.xz等の拡張子のついた圧縮ファイルの状態でも、そのままped.plで解析できます。
  解析結果一式は、momotarouのディレクトリに出力されます。
• 双方向アラインメント上の多型の確認
  pedディレクトリで
  
  $ perl search.pl target=target,chr=chromosome,pos=position
  
  を実行します。 例えば
  
  $ perl search.pl target=ERR5348982,chr=3,pos=67569398
  
  あるいは
  
  $ sudo docker run -w /ped -v `pwd`:/work akiomiyao/ped perl search.pl target=ERR5348982,chr=3,pos=67569398,wd=/work
  
  以下は、出力の一部です。
  

  # 3 67569398 3 67581683 f deletion -12291
  ACAACCAAAACAACATAGGA ATGTACCAATGCACGTTTAA 5
                                       Chr3 67569398
                                       |
  TTTTGACAACCAAAACAACATAGGAAAATTGGAAAACTGTAACGATTCAAAATTTTTTTTTTATATAAATAAGAATAAATAAGTATTTAAAGGGCGTAATTGTCCTTTCACGTTTTAAATGAATAAATAAATAAATAAATCAAAAACAGA
  |||||||||||||||||||||||||||||||||||||  |  |     ||  |||||         ||| |      |||    |||| |    |   |  ||     ||  | | ||   |  ||   |  ||   |     |||  | 
  TTTTGACAACCAAAACAACATAGGAAAATTGGAAAACATTTTCTGGAAAATGTTTTTCGCCATACCAAACACACCCTAATCTCAATTTTACATACTGCAAGGTTTGCGCAGCTCTGAAGAAATAAATGTACCAATGCACGTTTAAATTGC
  | | | |          |    ||        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
  TCTCGTCTGGGGTCTAGATTCCGGTCGTGACAAAAACATTTTCTGGAAAATGTTTTTCGCCATACCAAACACACCCTAATCTCAATTTTACATACTGCAAGGTTTGCGCAGCTCTGAAGAAATAAATGTACCAATGCACGTTTAAATTGC
                                 |
                                 Chr3 67581683
  
  # 3 67569398 3 67581683 f deletion -12291
  ACCAAAACAACATAGGAAAA CGTTTAAATTGCATAATTTG 0
                               Chr3 67569398
                               |
  ACCAAAACAACATAGGAAAATTGGAAAACTGTAACGATTCAAAATTTTTTTTTTATATAAATAAGAATAAATAAGTATTTAAAGGGCGTAATTGTCCTTTCACGTTTTAAATGAATAAATAAATAAATAAATCAAAAACAGATTTGTATT
  |||||||||||||||||||||||||||||  |  |     ||  |||||         ||| |      |||    |||| |    |   |  ||     ||  | | ||   |  ||   |  ||   |     |||  |  |  | | 
  ACCAAAACAACATAGGAAAATTGGAAAACATTTTCTGGAAAATGTTTTTCGCCATACCAAACACACCCTAATCTCAATTTTACATACTGCAAGGTTTGCGCAGCTCTGAAGAAATAAATGTACCAATGCACGTTTAAATTGCATAATTTG
           |    ||        ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
  GGGGTCTAGATTCCGGTCGTGACAAAAACATTTTCTGGAAAATGTTTTTCGCCATACCAAACACACCCTAATCTCAATTTTACATACTGCAAGGTTTGCGCAGCTCTGAAGAAATAAATGTACCAATGCACGTTTAAATTGCATAATTTG
                         |
                         Chr3 67581683
  

  vcfファイルは、indelの始まる一つ前の塩基の位置を出力しますが、ped.plのアラインメントでは、変異が始まった最初の塩基の位置を出力しています。
  indelのアラインメントの検索を行う場合は、vcfファイルの位置に1を加えた値で検索してください。
• 複数のの解析結果からの遺伝子型の比較
  $ perl compare.pl target=ERR5348981:ERR5348982
  とすると、ERR5348981とERR5348982のSNPの遺伝子型と確認用プライマー配列が表示されます。
  
  置換変異を見たい場合は、
  $ perl compare.pl target=ERR5348981:ERR5348982
  
  構造変異を見たい場合は、
  $ perl compare.pl target=ERR5348981:ERR5348982,type=sv
  とします。
  
  ファイルに出力したい場合は、
  $ perl compare.pl target=ERR5348981:ERR5348982 > result.txt
  のようにします。
  ターゲット(ディレクトリ)名を:で区切って target= の後に列挙すれば、結果の遺伝子型のカラムもその順に表示されます。
  オプションにスペースを入れないように注意してください。
  
  エクセルに取り込み、遺伝子型に色を付けるとセグメントがわかります。
  

PEDに関する資料

• スクリプト: https://github.com/akiomiyao/ped/
• 論文: Polymorphic edge detection (PED): two efficient methods of polymorphism detection from next-generation sequencing data (2019) BMC Bioinformatics 20(1):362

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