PEDを用いたイネの多型解析例

Ubuntuのインストール

• Ubuntu Desktop 日本語 Remixより日本語版のISOイメージのファイルをダウンロードします。
• Ubuntu 20.04 LTSインストールガイド【スクリーンショットつき解説】が詳しいので参考にしてインストールしてください。
  PEDは解析時間をできるだけ短くするため、CPUの限界近くまで負荷がかかりますのでほかのOSとの共存は避けた方がいいです。
  使わなくなった古いコンピュータなどにインストールして専用にするのがお勧めです。
  マルチスレッドで動作しますので、4あるいは8コアのCPUを用いると早く処理できます。

PEDのセットアップと解析例

• 必要なソフトをダウンロードとインストールを行います。

  $ sudo apt update
  $ sudo apt upgrade
  $ sudo apt install curl
  $ sudo apt install git
  $ sudo apt install sra-toolkit
  $ git clone https://github.com/akiomiyao/ped.git

• Ubuntuのバージョンによっては、sra-toolkitのインストールに失敗することがあります。
  また最近のバージョンのfastq-dumpは使用前にvdb-configコマンドで実行環境を設定する必要があります。
  設定方法は、[fastq-dumpの設定]のページに記載しました。
• NCBIのSRAアーカイブからコシヒカリのfastq形式のファイル(DRR099981)をダウンロードします。

  $ cd ped
  $ git pull
  $ perl download.pl accession=DRR099981

  git pullで最新のスクリプトに更新されます。git pullは毎回行う必要はありませんが、プログラムが更新されている場合はpullしてください。
  pedのディレクトリの中に、DRR099981の名称のディレクトリができて、その中のreadというディレクトリの中にfastqファイルがダウンロードされます。
  アメリカからのダウンロードなので時間がかかります。
  時々エラーが表示されますが自動的に再接続されるので、気長に待ちます。
  同様の構造の任意の名前のディレクトリを作れば手持ちのデータの解析ができます。
  
• DRR099981の配列をイネの参照配列IRGSP1.0にマップして多型を検出します。

  $ perl ped.pl target=DRR099981,ref=IRGSP1.0

  イネの参照配列は設定済みなので自動的にダウンロードして解析用データを作成して一連の作業が自動的に進みます。
  解析が無事終わるとDRR099981のディレクトリの中に、DRR099981.vcfという結果をまとめたファイルができます。
  各座位に対してプライマーが作成可能な場合は、プライマーペアの配列データも出力されます。

Dockerでの解析

• Dockerを用いれば、必要な時に設定済み実行環境を取り込んで解析できます。
  グーグルクラウド(GCP)やアマゾンウェブサービス(AWS)などのクラウドでの実行も可能です。
• Dockerのセットアップ
  $ sudo apt install docker
  $ sudo apt install docker.io
  
• 解析例
  $ sudo docker pull akiomiyao/ped
  $ sudo docker run -w /ped -v `pwd`:/work akiomiyao/ped perl download.pl accession=DRR099981,wd=/work
  $ sudo docker run -w /ped -v `pwd`:/work akiomiyao/ped perl ped.pl target=DRR099981,ref=IRGSP1.0,wd=/work
  上記のコマンドをコピーしてターミナルウインドウにペーストして実行してください。

IVGブラウザによる結果の確認

• Integrative Genomics Viewer (IVG) はBroad Instituteで作成されたゲノムブラウザです。
  IGV Web Appが便利です。
  IRGSP1.0.fasta IRGSP1.0.fasta.faiをダウンロードします。
  Genomesのプルダウンメニューより'Local File ...'を選んで、IRGSP1.0.fastaとIRGSP1.0.fasta.faiの両方を同時に選んでロードします。
  transcripts.gffをダウンロードして、 Tracksのプルダウンメニューより'Local File ...'を選んでロードします。
  DRR099981.vcfをダウンロードして、 Tracksのプルダウンメニューより'Local File ...'を選んでロードします。
  個別の染色体を選んで拡大していくと多型が表示されます。
  fastaの右端にある設定ボタンより、Three-frame Translateを選ぶとアミノ酸配列が表示されます。Reverseを選ぶと相補鎖側の配列が表示されます。
• デスクトップ版は、http://software.broadinstitute.org/software/igv/download からダウンロードできます。
  IRGSP1.0.fastaをダウンロードします。
  IVGを開いてGenomesのプルダウンメニューよりLoad Genome from Fileを選んで、IRGSP1.0.fastaを選んでロードします。
  locus.gff
  transcripts.gff
  transcripts_exon.gff
  をダウンロードして、メインの表示ボックスの下のサブのボックスにドラッグします。
  DRR099981.vcf
  をメインの表示ボックスにドラッグすれば、コシヒカリの多型データが取り込まれます。
  各染色体の番号をクリックすると、染色体ごとの多型情報が表示されます。
  興味のある部分をクリックすると、どんどん拡大されます。
  多型をマウスで指すと詳細情報が表示されます。
  多型の種類や多型頻度、また、プライマー対の配列情報と増幅産物のサイズも表示されます。
  ページのトップの画像が表示例です。クリックすると大きくなります。
  多型の部分を増幅するプライマー配列も表示されます。至適配列が見つからない部位では表示されません。
• 注意点 IVGでは長い欠失や転座の情報をうまく表示できない場合があるので、転座と80塩基以上の欠失に関しては、vcfファイルに出力しないように設定しています。
  大きな構造変異を調べたい場合は、targetのディレクトリの中に出力された、svの拡張子のついたファイルを直接ご参照ください。

コシヒカリ類縁品種の多型の比較

$ cd ped
$ perl download.pl accession=DRR099981

$ mv DRR099981 koshihikari

$ perl ped.pl target=koshihikari,ref=IRGSP1.0

$ perl compare.pl target=genkitsukushi:hinohikari:hitomebore:hoshinoyume:koshihikari:koshihikari_sbl1:nipponbare:tenkomori:tentakaku > snp.txt
$ perl compare.pl target=genkitsukushi:hinohikari:hitomebore:hoshinoyume:koshihikari:koshihikari_sbl1:nipponbare:tenkomori:tentakaku,type=sv > sv.txt

PEDに関する資料

• スクリプト: https://github.com/akiomiyao/ped/
• 論文: Polymorphic edge detection (PED): two efficient methods of polymorphism detection from next-generation sequencing data (2019) BMC Bioinformatics 20(1):362

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