PEDを用いた高度好熱菌の多型解析例

• 図をクリックすると拡大されます。
  
• SNP以外に、挿入・欠失変異も正確に検出できる特徴があります。
• 変異部分を増幅するプライマー対の配列も得られます。

Ubuntuのインストール

• Ubuntu Desktop 日本語 Remixより日本語版のISOイメージのファイルをダウンロードします。
• Ubuntu 20.04 LTSインストールガイド【スクリーンショットつき解説】が詳しいので参考にしてインストールしてください。
  PEDは解析時間をできるだけ短くするため、CPUの限界近くまで負荷がかかりますのでほかのOSとの共存は避けた方がいいです。
  使わなくなった古いコンピュータなどにインストールして専用にするのがお勧めです。
  マルチスレッドで動作しますので、4あるいは8コアのCPUを用いると早く処理できます。

PEDのセットアップと解析例

• 必要なソフトをダウンロードとインストールを行います。

  $ sudo apt update
  $ sudo apt upgrade
  $ sudo apt install curl
  $ sudo apt install git
  $ sudo apt install sra-toolkit
  $ git clone https://github.com/akiomiyao/ped.git

• Ubuntuのバージョンによっては、sra-toolkitのインストールに失敗することがあります。
  また最近のバージョンのfastq-dumpは使用前にvdb-configコマンドで実行環境を設定する必要があります。
  設定方法は、[fastq-dumpの設定]のページに記載しました。
• NCBIのSRAアーカイブからサンプル名 ERS2739520のfastq形式のファイル(ERR2796891)をダウンロードします。
  

  $ cd ped
  $ git pull
  $ perl download.pl accession=ERR2796891

  git pullで最新のスクリプトに更新されます。git pullは毎回行う必要はありませんが、プログラムが更新されている場合はpullしてください。
  pedのディレクトリの中に、ERR2796891の名称のディレクトリができて、その中のreadというディレクトリの中にfastqファイルがダウンロードされます。
  
• ERR2796891の配列は長さが不ぞろいなので、check_length.plで事前の長さ別のリード数の分布を調べます。

  $ perl check_length.pl target=ERR2796891
  前半略
  90      244
  91      262
  92      357
  93      496
  94      688
  95      1034
  96      1509
  97      2035
  98      3119
  99      4317
  100     22298
  101     156098
  

  この場合は、101塩基が最長で、100塩基もそこそこあるので、clipping=100で計算します。
• ERR2796891の配列を高度好熱菌の参照配列KOD1にマップして多型を検出します。

  $ perl ped.pl target=ERR2796891,ref=KOD1,clipping=100

  高度好熱菌の参照配列は設定済みなので自動的にダウンロードして解析用データを作成して一連の作業が自動的に進みます。
  解析が無事終わるとERR2796891のディレクトリの中に、ERR2796891.vcfという結果をまとめたファイルができます。
  各座位に対してプライマーが作成可能な場合は、プライマーペアの配列データも出力されます。
• 注意点 IVGでは長い欠失の情報をうまく表示できない場合があるので、80塩基以上の欠失に関しては、vcfファイルに出力しないように設定しています。
  大きな構造変異を調べたい場合は、targetのディレクトリの中に出力された、svの拡張子のついたファイルを直接ご参照ください。
  

Dockerでの解析

• Dockerを用いれば、必要な時に設定済み実行環境を取り込んで解析できます。
  グーグルクラウド(GCP)やアマゾンウェブサービス(AWS)などのクラウドでの実行も可能です。
• Dockerのセットアップ
  

  $ sudo apt install docker
  $ sudo apt install docker.io

• 解析例
  

  $ sudo docker pull akiomiyao/ped
  
  $ sudo docker run -w /ped -v `pwd`:/work akiomiyao/ped perl download.pl accession=ERR2796891,wd=/work
  $ sudo docker run -w /ped -v `pwd`:/work akiomiyao/ped perl check_length.pl target=ERR2796891,wd=/work
  $ sudo docker run -w /ped -v `pwd`:/work akiomiyao/ped perl ped.pl target=ERR2796891,ref=KOD1,clipping=100,wd=/work

  上記のコマンドをコピーしてターミナルウインドウにペーストして実行してください。
  

IVGブラウザによる結果の確認

• Integrative Genomics Viewer (IVG) はBroad Instituteで作成されたゲノムブラウザです。
  http://software.broadinstitute.org/software/igv/download からダウンロードできます。
  KOD1.fastaをクリックしてダウンロードします。
  IVGを開いてGenomesのプルダウンメニューよりLoad Genome from Fileを選んで、KOD1.fastaをロードします。
  GCF_000009965.1_ASM996v1_genomic.gff をクリックしてダウンロードして、メインの表示ボックスにドラッグします。
  ERR2796891.vcf(クリックしてダウンロードできます)
  をメインの表示ボックスにドラッグすれば、Thermococcus kodakarensis KOD1 strain ERS2739520の多型データが取り込まれます。
  各染色体の番号をクリックすると、染色体ごとの多型情報が表示されます。
  興味のある部分をクリックすると、どんどん拡大されます。
  多型をマウスで指すと詳細情報が表示されます。
  多型の種類や多型頻度、また、プライマー対の配列情報と増幅産物のサイズも表示されます。
  ページのトップの画像が表示例です。
  多型の部分を増幅するプライマー配列も表示されます。至適配列が見つからない部位では表示されません。

PEDに関する資料

• スクリプト: https://github.com/akiomiyao/ped/
• 論文: Polymorphic edge detection (PED): two efficient methods of polymorphism detection from next-generation sequencing data (2019) BMC Bioinformatics 20(1):362

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